Új módszerek a HIV direkt kimutatására vérplazmában

Nyomtatóbarát változatKüldés e-mail-benPDF
Cikk: 
Dr. Ujhelyi Eszter (OHVII, Budapest)

A HIV fertõzés igazolása még ma is elsõsorban a specifikus ellenanyagok kimutatásán alapul. Ez azzal magyarázható, hogy a szerokonverzió után, a betegség egész idõtartama során ezek az antitestek jelen vannak, míg szabad vírus antigén csak a szerokonverzió elõtt igen rövid ideig, néhány napig, és a betegség elõrehaladott stádiumában mutatható ki. Az AIDS kutatás eredményei és az anti-HIV terápia igényei azonban nyilvánvalóvá tették, hogy szükség van a HIV vírus közvetlen kimutatására és mennyiségének meghatározására is a betegek vérében. Ennek indokai a következõk lehetnek:
 
a) Az új antivirális szerek kipróbálását rendkívüli mértékben meggyorsíthatja az, ha e szerek hatékonyságát nem csak a klinikai paraméterek (a CD4+ sejtszám alakulása, az AIDS kifejlõdése, az AIDS okozta halálozás) alapján ítélnék meg, mivel ebben az esetben hosszú évekig kell az eredményre várni. Ha a szer hatékony, akkor az várható tõle, hogy gyorsan és jelentõs mértékben csökkenti a HIV szervezetben lévõ össz-mennyiségét, amelyet jól tükröz a vérplazmában lévõ HIV partikulák, ill. a HIV-RNS mennyisége. Ugyanakkor a kezelésre használt szer iránti rezisztencia kifejlõdését a HIV mennyiségének ismételt növekedése kíséri a szervezetben (l. a következõ cikket).
 
b) A legújabb vizsgálatok szerint, a HIV össz-mennyiség emelkedése a szervezetben a HIV betegség progressziójával a legerõsebben korrelláló laboratóriumi marker, ezért a plazmában jelenlévõ HIV mennyiség meghatározására felhasználható prediktív eljárásként is.
 
c) A HIV direkt mérésével a betegben, és állatkísérletes modelleken igen lényeges, a betegség mechanizmusára vonatkozó ismeretek nyerhetõk.
d) Elméleti szempontból, és egyes esetekben, a gyakorlatban is fontos lehet a vírus vagy a vírus antigének közvetlen kimutatása a HIV fertõzés igazolására a szerokonverzió elõtti idõszakban.
e) Az anyai eredetû antitestek jelenléte miatt az ellenanyag kimutatásán alapuló diagnosztika nem alkalmas annak az eldöntésére, hogy egy HIV fertõzött anya újszülöttje fertõzötten született-e vagy sem. Ilyenkor is a vírus vagy a vírus-antigén direkt kimutatása a leghasználhatóbb eljárás.
 
A HIV-nek a vérplazmában való mérésére többféle eljárás is lehetséges:
A legspecifikusabb eljárás természetesen a vírus izolálása, azonban tömeges alkalmazhatóságának határt szab relatíve alacsony szenzitivitása, munkaigényessége és költségessége.
A HIV-antigének közül elsõsorban a p24 core antigén vérsavóból való kimutatása terjedt el, mivel a p24 megjelenése a betegség késõi stádiumában régóta ismert prognosztikai, az AIDS kifejlõdését elõrejelzõ marker. A HIV-betegség tünetes stádiumában, ill. a HIV pozitív anyák újszülöttjeiben azonban a p24 antigén nincs jelen szabad formában, hanem ellenanyaghoz kötve, immunkomplex formájában kering. Ezért több cég is kidolgozott olyan eljárásokat, melyek a p24 antigént - alacsony pH-n történõ kezelés segítségével - az immunkomplexból felszabadítják, és mérhetõvé teszik. Ezek a módszerek általában azon az elven alapulnak, hogy a savkezelés az antitesteket elroncsolja, a p24 antigén azonban teljesen vagy részben intakt marad. Az ilyen eljárásokat, pl. a Coulter cég kitjét eredményesen alkalmazzák a HIV fertõzöttség igazolására HIV pozitív anyák újszülöttjeiben, azonban e módszerek nem eléggé érzékenyek az antiviráis terápia monitorozására.
 
A vérplazma HIV tartalmának meghatározására a jövõben nagy valószínûséggel elsõsorban a HIV-RNS mérését fogják alkalmazni. E célra a kísérletes és klinikai vizsgálatokban is már hosszú évek óta használják az un. PCR (polymerase chain reaction) módszert. Ennek lényege az, hogy megfelelõ eljárás segítségével a HIV-RNS meghatározott, un. primerek által kijelölt szakaszát megsokszorozzák (egy molekulából kb. 1 millió másolatot készítenek), és az amplifikált terméket mérik.
A PCR eljárásnak azonban több hátránya van: a) speciális, gyors hõmérsékletváltoztatásokat lehetõvé tevõ készüléket igényel, b) nehezen tehetõ kvantitatívvá, c) minimális szennyezés is ál-pozitív eredményeket okozhat. Ezt felismerve, a különbözõ cégek a legutóbbi idõben olyan eljárásokat dolgoztak ki, melyek a PCR technika hátrányait kiküszöbölik, és ugyanakkor elérik, sõt meg is haladják ennek érzékenységét. Két ilyen eljárást szeretnék a továbbiakban ismertetni, melyek valószínûleg már a közeljövõben nagy jelentõségûek lesznek a klinikai gyakorlatban:
 
1. A HIV-1 RNS humán plazmában történõ kimutatására szolgáló egyik eljárást az amerikai CHIRON cég dolgozta ki. A módszer az un. ?branched DNA signal amplification assay?-n alapul és a kit Quantiplex TM HIV-RNA assay néven kerül forgalomba.
A branched (elágaztatott) DNA (bDNA) amplifikációs eljárás elvileg különbözik a PCR reakciótól. Az utóbbi módszer azon alapul, hogy a vírus genom nukleinsavait enzimatikus reakció segítségével sokszorozzuk meg, hasonlóan ahhoz, ahogy ez a sejten belül, a vírus-replikáció során történik. Ezzel ellentétben a bDNA assay az un. jel-amplifikációs problémák közé tartozik. A reakció folyamán a vírus nukleinsavakat, pl. a HIV-RNS molekulákat nem sokszorozzák meg, hanem a vizsgálandó anyagban (pl. a vérplazmában) természetesen jelenlévõ koncentrációban szilárd fázisokhoz kötik. Az amplifikációt ezután úgy érik el, hogy egy RNS molekulához hozzá specifikusan kötõdõ elágaztatott DNS struktúrán keresztül nagyszámú, több, mint 1000 jel-molekulát, pl. alkalikus foszfatázt kötnek. Végül az enzimmel jelzett DNS struktúrákat egy szubsztrát hozzáadása után az igen érzékeny chemil lumineszcenciás reakció segítségével mutatják ki, és mérik ilyen módon a vizsgált mintában jelenlévõ specifikus RNS mennyiségét.
 
A cég eddig a HIV-RNS-en kívül a HCV-RNS és a HBV-DNS kimutatására hozott forgalomba a bDNA assay-n alapuló kiteket. A módszer elõnyei: minimálissá válik a contaminatio által okozott ál-pozitív reakciók veszélye, az eljárás olcsóbb, mint a PCR, és az eredmények kvantitatívak. A bDNA assay segítségével már 1000 vírus partikula jelenléte is kimutatható a vizsgált plazmamintában.
A Quantiplex TM assay-val végzett vizsgálat menete a következõ:
a) a plazma centrifugálása 23500 g-n, hûthetõ asztali centrifugában,
b) az üledékben lévõ vírus lizálása, az RNS-t bontó enzimek elroncsolása, és az RNS felszabadítása. Az így kezelt mintát centrifugálás után azonnal 96 lyukat tartalmazó mikrotitráló lemezek a HIV-RNS-t specifikusan kötõ un. capture reagensekkel fedett mélyedéseibe kell pipettázni. 53 oC-on történõ, éjszakán át tartó inkubálás során a vírus-RNS a lizátumból a lemezekhez kötõdik,
 
c) mosás után a megsokszorozóként (amplifier) szolgáló elágaztatott DNS molekulákat pipettázzuk a mélyedésekbe, melyek specifikusan kapcsolódnak a lemezhez kötött vírus RNS-hez,
d) újabb mosás után bepipettázzuk az alkalikus foszfatázzal jelzett reagenst, melyek az elágazódó DNS ?bokor?-hoz kapcsolódik,
e) végül a chemilumineszcenciális szubsztrát (dioxetan) adagolása fény felvillanást eredményez, amely luminométeren leolvasható.A fénykibocsátás a vizsgált mintában jelenlévõ vírus-RNS mennyiségével egyenesen arányos.
 
2. Az ORGANON TEKNIKA cég 1994-es nagy metodikai áttörése volt a NASBA (nucleic acid sequence-based ampification) módszeren alapuló HV-RNS mérési kit bevezetése.
 
A NASBA rendszer, hasonlóan a Chiron Quantiplex tesztjéhez, a HIV-1 RNS-t plazmából mutatja ki. Két változatát hozták forgalomba. Az egyik, a HIV-1 NASBTM kvalitatív módszer, a HIV-RNS igen kis mennyiségét (10-100 HIV-1 RNS molekulát) képes detektálni, de kvantitatív meghatározásra nem alkalmas. A másik variáns, a NASBA HIV-1 RNA QT szintén igen érzékeny, mintánként 600 HIV-1 RNS kópiát lehet kimutatni alkalmazásával, és igen pontos kvantitatív meghatározást tesz lehetõvé széles dózistartományban.
 
A két variánsban alkalmazott kezdeti lépések azonosak. Ezeknek lényege, az alapul szolgáló NASBA módszernek megfelelõen, a következõ: különbözõ enzimek és a HIV-1 RNS egy adott szakaszának két végéhez kapcsolódni képes primerek keverékét adják a vizsgálati mintához. Ezután a mintában jelenlévõ HIV-RNS-nek a primerek által kiválasztott szakaszához DNS hibridizálódik, melynek lánca az RNS-sel komplementer. Ezután az eredeti RNS-t enzimatikusan elroncsolják, majd a DNS-rõl kb. 100 RNS másolat készül egy másik enzim segítségével. Ekkor az egész folyamat elölrõl kezdõdik. Ily módon 4-5 ciklus után 1 RNS molekuláról 1 milliárd kópia készül.
 
A módszer 3 fõ elõnye: a) Nem érzékeny a DNS kontaminációra, ezért igen specifikus, b) a PCR reakcióval szemben, amely minden ciklus során hõmérséklet váltztatásokat igényel, a NASBA reakció végig azonos hõmérsékleten, 42 oC-on játószódik le, c) Léyegesen kevesebb ciklussal ér el azonos mértékû amplifikációt, mint a PCR, és így csökken a ciklusok számával egyenesen arányos hibás kópiák száma.
 
A két HIV-1 NASBA próba még egy speciális ?trükköt? alkalmaz: a vizsgálati mintában található ?vad típusú? RNS-sel együtt megsokszoroz (ko-amplifikál) háromféle, a vad típustól csak néhány nucleotidban különbözõ, kalibrátorként szolgáló RNS molekulát is, és ezek arányából következtet vissza a HIV-1 RNS eredeti mennyiségére a vizsgált mintában.
 
A kvalitatív teszt az un. ELGA (enzyme linked gel assay) segítségével mutatja ki az amlifikált minta- és kalibrátor-RNS termékeket. A dektálás torma-peroxidáz próbával való hibridizáláson alapul, a leolvasás szabad szemmel történik.
 
A kvantitatív tesztben az amplifikált vad típusú és kalibrátor RNS reagenseket egy rendkívül érzékeny eljárás, az un. electro-chemilumineszcencia segítségével mutatjuk ki. A mérés speciális automata készüléken történik.
 
A gyártó cég szerint a kvantitatív eljárás alkalmas a betegség progressziójának monitorozására és elõrejelzésére, valamint a gyógyszer- és vakcinakipróbálások céljára. Mindkét eljárás rövid idõ, 5 óra alatt végrehajtható.
 
A cikk elején részletesen ismertetett felhasználási lehetõségek érthetõvé teszik a cégek érdeklõdését a HIV-1 RNS mérési eljárások iránt. Ezért már a közeljövõben várható ugyanerre a célra szolgáló másféle diagnosztikai készletek forgalomba hozatala.